L'ictus ischemico è la principale causa di morte e disabilità permanente. Nonostante i recenti e sostanziali progressi nella prevenzione e nel trattamento, l’identificazione di terapie efficaci rimane ancora una necessità. Gli studi condotti nel laboratorio “Ictus e Disfunzioni Vascolari”, in collaborazione con il nostro laboratorio, hanno suggerito il ruolo cruciale della lectina legante il mannosio (MBL) - una delle molecole di riconoscimento della via delle lectine del complemento - nel danno ischemico cerebrale, ipotizzando che MBL possa quindi rappresentare un bersaglio terapeutico rilevante nell'uomo. Il nostro gruppo ha sviluppato nuovi metodi basati sulla Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR) che sono stati, e sono attualmente, applicati per identificare molecole o nanoparticelle funzionalizzate in grado di contrastare gli effetti dannosi di MBL. Questi composti hanno attività neuroprotettiva in modelli animali sottoposti a ischemia, suggerendo che possano rappresentare una promettente strategia terapeutica per l’ictus cerebrale ischemico.

In questi anni sono molti i farmaci biologici, inclusi gli anticorpi monoclonali, che sono stati approvati nella pratica clinica per il loro beneficio terapeutico, un numero in costante crescita per le loro potenzialità. Uno dei problemi di questi farmaci è però l'immunogenicità, ovvero la produzione di anticorpi anti-farmaco che possono influenzare l'attività (se sono anticorpi neutralizzanti) e/o le proprietà farmacocinetiche del farmaco, con conseguente perdita di risposta clinica. A questo riguardo, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo test che utilizza la tecnologia della Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR) per misurare simultaneamente il farmaco e gli anticorpi anti-farmaco nel sangue dei pazienti, rivelando importanti problematiche dei tradizionali test ELISA. Questo test è stato applicato con successo per studiare gli anticorpi anti-Infliximab, un farmaco biologico anti-TNF usato per diverse malattie autoimmuni. Attualmente stiamo applicando questo metodo per misurare gli anticorpi sviluppati dai pazienti trattati con farmaci PEGilati, sia anti-farmaco che anti-PEG, per determinare la loro rilevanza nella risposta alla terapia. La conoscenza di questi dati per ogni singolo paziente potrebbe consentire ai medici di personalizzare e ottimizzare la terapia. A questo riguardo, prevediamo anche di sviluppare, in collaborazione con dipartimenti di ingegneria, nuovi dispositivi miniaturizzati e portatili per consentire un'analisi rapida, semplice ed economica da poter essere effettuata presso il punto di cura.

Stiamo attualmente sviluppando una piattaforma completa per la progettazione, la produzione e la validazione rapida e affidabile di miniproteine ingegnerizzate, stabili e altamente specifiche per il target biologico di interesse. La piattaforma integra la progettazione de novo basata su modelli di machine learning e strumenti di intelligenza artificiale generativa come RFdiffusion e BindCraft. Successivamente, le molecole progettate in silico vengono prodotte utilizzando metodi differenti, tra cui la sintesi peptidica in fase solida (SPPS), sistemi di espressione cell-free e produzione ricombinante in cellule. L’identificazione del metodo più efficiente è seguita poi dalla caratterizzazione sperimentale della proteina prodotta, usando tecniche biofisiche come la Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR) e la Dicroismo Circolare (DC) per valutare l'affinità di legame, la stabilità e le proprietà strutturali. La versatilità della piattaforma consente la sua applicazione su molteplici bersagli biologici implicati in diverse patologie. Le principali applicazioni attuali riguardano: - miniproteine in grado di legare la gelsolina, una proteina implicata nell'amiloidosi e nel cancro, per investigare le sue interazioni patologiche e i meccanismi di aggregazione; - miniproteine in grado di legare le proteine isomerasi disulfuro (PDI) e/o ERO1a, implicate in diversi tumori, con lo scopo di interferire con la loro interazione e quindi di modulare lo stress ossidativo e il folding delle proteine coinvolte nella progressione del tumore. - miniproteine in grado di legare la Clusterina extracellulare determinandone la degradazione lisosomiale selettiva, utilizzando la strategia LYTAC (Lysosome-Targeting Chimera). Questo approccio può essere rilevante per quelle malattie in cui l'accumulo eccessivo di clusterina gioca un ruolo patologico, come i disturbi neurodegenerativi e alcuni tumori. - miniproteine come strumenti diagnostici, ad esempio in un progetto finalizzato al rilevamento di malattie zoonotiche.

Oltre all'ingegnerizzazione delle miniproteine, il nostro laboratorio è attivamente impegnato, in collaborazione con dipartimenti di Medicinal Chemistry, nello sviluppo di nuove small molecules con potenziali applicazioni terapeutiche. Per questo, il laboratorio utilizza il docking molecolare assistito da intelligenza artificiale, lo screening farmacologico classico e approcci di chimica farmaceutica per sviluppare de novo composti. Uno dei progetti attualmente in corso riguarda molecole in grado di legare e modulare il recettore degli ormoni tiroidei alfa (TRα1).

Il laboratorio ha una vasta esperienza nella sintesi peptidica in fase solida (SPPS), effettuata con due sintetizzatori peptidici automatizzati che consentono la sintesi di fino a 96 peptidi simultaneamente, con lunghezze fino a 70-100 amminoacidi, o modifiche specifiche negli amminoacidi (ad esempio, con D-amminoacidi, peptidi ciclici o peptidi funzionalizzati con sonde come un fluoroforo o biotina). La sequenza e la purezza dei peptidi vengono poi confermate utilizzando HPLC e spettrometro di massa MALDI-TOF. Alcuni esempi sono riportati di seguito: - sintesi dei peptidi beta-amiloide (Aβ 1-40, Aβ 1-42), e di derivati progettati per ridurre l'aggregazione di Aβ; - sintesi di peptidi ciclici in grado di prevenire l'ingresso di SARS-COV 2 nelle cellule, progettati per interferire con l'interazione tra la proteina Spike del virus e il suo bersaglio, l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2); - sintesi di peptidi derivati da musclin, una proteina coinvolta nella cachessia (perdita di massa muscolare) e nel deterioramento osseo nel cancro, e potenzialmente utili per il trattamento farmacologico di queste condizioni; - sintesi di peptidi oncolitici come agenti terapeutici per il cancro alla mammella e gastrico.

I dati ottenuti nel Dipartimento di Medicina Cardiovascolare (ora Dipartimento di Danno Cerebrale e Cardiovascolare Acuto), in collaborazione con il nostro laboratorio, hanno rivelato che una via metabolica, chiamata ‘via delle chinurenine’, viene attivata immediatamente dopo arresto cardiaco ed è associata alla gravità dello shock post-arresto cardiaco, alla morte precoce e a un esito a lungo termine negativo. Inoltre, i nostri dati in un modello animale di arresto cardiaco hanno mostrato alterazioni dei metaboliti della ‘via delle chinurenine’ nel cervello, suggerendo un ruolo nella cascata di eventi molecolari alla base del danno cerebrale indotto da arresto cardiaco. Attualmente stiamo misurando i metaboliti della ‘via delle chinurenine’ in pazienti con che hanno subito arresto cardiaco e ventilati con Argon (studio CPAr, NCT05482945), per rivelare una possibile associazione tra il potenziale effetto benefico dell'Argon e la risposta della “via delle chinurenine”. Inoltre, considerando il ruolo della ‘via delle chinurenine’ in vari disturbi neurologici come conseguenza di neuroinfiammazione e danno cerebrale, prevediamo di utilizzare il metodo UHPLC-MS/MS che abbiamo sviluppato per indagare il coinvolgimento della ‘via delle chinurenine’ in altre condizioni patologiche che impattano sulla salute del sistema nervoso centrale.

Il trattamento antibiotico nei pazienti critici in terapia intensiva è complesso, a causa dei cambiamenti fisiopatologici che si verificano in questi pazienti e che possono alterare le proprietà farmacocinetiche degli antibiotici, risultando in trattamenti inefficaci o dannosi. Il laboratorio di Clinical Data Science e il gruppo GiViTI stanno conducendo uno studio clinico multicentrico, AbioKin (Farmacocinetica degli Antibiotici, NCT02609646), con l'obiettivo di sviluppare un modello matematico che integri le caratteristiche del paziente e i parametri clinici, per ottimizzare la terapia antibiotica. In questo contesto, abbiamo sviluppato e validato un metodo UHPLC-MS/MS rapido e sensibile in grado di rilevare e quantificare simultaneamente i cinque antibiotici comunemente usati nelle Unità di Terapia Intensiva (ossia Vancomicina, Linezolid, Piperacillina/Tazobactam e Meropenem). Il metodo è attualmente applicato per misurare le concentrazioni di antibiotici, in migliaia di campioni plasmatici dei pazienti arruolati nello in questo studio AbioKin, per investigare la farmacocinetica di questi antibiotici in relazione alle caratteristiche dei pazienti, ai parametri clinici e all’utilizzo di terapie extracorporee.

Il laboratorio contribuisce a diversi studi condotti in modelli animali, sviluppando e applicando nuovi metodi bioanalitici per misurare i livelli di farmaco nel plasma e nei tessuti biologici rilevanti (ad esempio, cervello o fegato), al fine di comprendere meglio i loro effetti farmacologici e le relazioni PD-PK. Alcuni di questi studi riguardano: - PK di due inibitori della tirosina chinasi (Imatinib e Nintedanib) e di un inibitore della Janus chinasi (Ruxolitinib) incapsulati in formulazioni liposomiali in modelli murini di ipertensione polmonare e fibrosi post-infiammatoria; - PK e ottimizzazione della dose di due inibitori delle proteine da shock termico come potenziali farmaci senolitici, in un modello murino transgenico di senescenza; - PK di anticorpi terapeutici, valutata con metodi innovativi sviluppati nel laboratorio e basati sulla Risonanza Plasmonica di Superficie.

Il laboratorio è stato coinvolto in diversi studi riguardanti il possibile “repurposing” della doxiciclina: cioè l’utilizzo di questo farmaco, già molto ben conosciuto per la sua attività antibiotica, per il trattamento di amiloidosi centrali e periferiche (Malattia di Alzheimer, malattia prionica, amiloidosi da β2-microglobulina o transtiretina). In particolare, abbiamo valutato sia gli effetti farmacodinamici del farmaco (ad esempio, l'interazione con – e gli effetti su – proteine amiloidogeniche e i loro aggregati), sia le sue proprietà farmacocinetiche, valutate su modelli animali e in pazienti. L'integrazione dei dati farmacodinamici e farmacocinetici ha permesso di proporre un nuovo potenziale meccanismo d'azione del farmaco per gli effetti nelle amiloidosi.